Pe urmele testelor de microbiom: compararea tehnicilor 16S rRNA și Shotgun

Microbiologia medicală a tractului intestinal, cercetarea microbiomului, studiază colonizarea microbiană a tractului intestinal, care joacă un rol vital pentru sănătate. Această comunitate microbiană – alcătuită din bacterii, virusuri, fungi și alte microorganisme – interacționează cu organismul-gazdă, este în legătură practic cu toate sistemele de organe și influențează metabolismul, hormonii, sistemul imunitar și chiar creierul.

În ultimii ani, tot mai multe persoane apelează la testarea microbiomului, fie din cauza unor tulburări digestive, probleme ale pielii, oboseală cronică, fie chiar pentru recomandări nutriționale personalizate. Cine dorește să efectueze o astfel de analiză constată repede că nu numai numărul furnizorilor a crescut, ci și tehnologiile de testare pe care aceștia le folosesc diferă considerabil.

Printre metodele mai tradiționale de analiză a scaunului se numără examinarea macroscopică a scaunului: observarea consistenței, culorii, a resturilor de grăsime, mucus și sânge, a particulelor alimentare nedigerate, precum și determinarea valorii pH (care poate indica o disbioză). Pe lângă acestea, se folosesc și analize imunologice, de exemplu detectarea sângelui ocult sau căutarea markerilor care indică un cancer intestinal. Nivelul substanțelor care semnalează inflamația și integritatea mucoasei – precum calprotectina, lactoferina, alfa-1-antitripsina și histamina – poate fi, de asemenea, măsurat. Nivelul elastazei pancreatice oferă informații despre funcția exocrină a pancreasului. Printre alte analize clasice se numără examinările microbiologice și parazitologice microscopice, precum și cultivarea culturilor din scaun. Pot fi detectate și toxine de Clostridium sau prezența Salmonellei.

Există metode moderne de analiză care nu studiază speciile bacteriene, ci produșii lor metabolici, adică metaboliții acestora. Astfel de substanțe sunt, de exemplu, triptofanul, serotonina, GABA, indolul și derivații săi (de ex. triptamina, acidul kinurenic, p-crezolul), precum și diferitele forme de acizi biliari (liberi, conjugați, cu efect protector sau care lezează celulele). Aceste substanțe pot oferi informații importante despre starea fizică și psihică a pacientului, precum și despre posibilele cauze ale simptomelor. Un dezavantaj al acestora este că nu se cunoaște în toate cazurile exact care bacterii participă la procesele respective.

Odată cu dezvoltarea tehnologiei au apărut metode de analiză a florei din scaun bazate pe date genetice. Printre cele mai frecvente metode se numără secvențierea bazată pe 16S rRNA și secvențierea metagenomică shotgun.

Este important să distingem testele de microbiom menționate anterior de analizele clasice ale scaunului efectuate de rutină în spitale, care servesc unui scop cu totul diferit. Analizele de scaun din spitale acoperă doar câteva zeci de microorganisme cunoscute și nu sunt menite să ofere o imagine cuprinzătoare asupra întregii compoziții a microbiomului intestinal sau a funcționării acestuia.

Secvențierea bazată pe 16S rRNA: simplă, dar limitată

Analiza bazată pe 16S rRNA ^1–2 este una dintre cele mai frecvent folosite metode din zilele noastre pentru cartografierea microbiomului intestinal. Această procedură studiază un segment genic al bacteriilor, bine conservat evolutiv, dar ușor diferit de la o specie la alta – ARN-ul ribozomal 16S. Analiza secvenței 16S rRNA este, de cele mai multe ori, precisă până la nivelul genului, deoarece această genă poate fi foarte asemănătoare între unele specii, mai ales în cazul rudelor apropiate. Așadar, în timp ce genul („numele de familie”) se distinge clar, specia exactă („prenumele”) uneori se „estompează”.

Marele avantaj al metodei este că este rapidă, rentabilă și ușor de standardizat din punct de vedere tehnic, motiv pentru care este utilizată pe scară largă atât în cercetarea științifică, cât și în analizele de laborator cu scop comercial. Popularitatea sa a crescut după anul 2000, în paralel cu dezvoltarea tehnologiilor de secvențiere a ADN-ului. Numeroase inițiative internaționale (American Gut Project sau Atlas Biomed) folosesc, de asemenea, această tehnică.

Metoda se limitează în principal la studierea bacteriilor, astfel încât nu este potrivită pentru identificarea altor microorganisme, precum virusurile. În plus, este capabilă doar într-o măsură limitată de identificare la nivel de specie și nu oferă informații despre proprietățile funcționale ale microorganismelor, de exemplu dacă acestea produc toxine, metaboliți sau dacă prezintă rezistență la antibiotice. Această tehnologie este capabilă, de regulă, să diferențieze câteva mii de specii.

Principalele avantaje:

• Ușor de realizat, economică, rapidă
• Potrivită pentru cartografierea generală a comunității bacteriene
• Validată pe scară largă

Limitele sale:

• Studiază doar bacteriile; alte microorganisme (fungi, virusuri) nu pot fi detectate cu ajutorul ei
• Precizia sa este valabilă în principal la nivelul genului, mai puțin la nivel de specie sau deloc
• Nu oferă informații despre metabolismul sau funcționarea microbilor

Secvențierea metagenomică shotgun: funcție și precizie

Metagenomica shotgun ^3–4 este o procedură de analiză modernă, de înaltă rezoluție, care poate dezvălui nu doar compoziția microbiomului, ci și activitatea sa funcțională. Esența metodei constă în faptul că analizează nu doar un singur segment genic, ci întregul ansamblu de ADN al comunității microbiene, oferind astfel o imagine mult mai detaliată și mai precisă despre ce microorganisme se găsesc în probă și la ce procese biologice participă acestea.

Cu ajutorul acestei tehnologii pot fi identificate nu doar bacterii, ci și virusuri, fungi și paraziți. În plus, devine posibilă și detectarea genelor funcționale care joacă un rol în metabolism, în producerea de vitamine și metaboliți, în producerea de toxine sau în dezvoltarea rezistenței la antibiotice. Este important de subliniat că, în sine, cantitatea mare de date genetice nu este suficientă; pentru rezultate cu adevărat interpretabile este nevoie de algoritmi bioinformatici fiabili și avansați, capabili să prelucreze și să interpreteze cu exactitate datele. Numeroase institute de cercetare și furnizori de servicii de diagnostic de top pe plan internațional (de exemplu CosmosID, Microba sau Onegevity) folosesc această metodă.

Principalele avantaje:

• Analiză completă a genomului, identificare la nivel de specie
• Identifică virusuri, fungi, arhee
• Poate diferenția potențial câteva zeci de mii de specii bacteriene
• Cartografiază și funcțiile: ce produc și de ce sunt capabili microbii (producerea de acizi grași cu lanț scurt, producerea de metan, producerea de toxine, gene de rezistență la antibiotice)
• Poate fi utilizată în scopuri clinice și pentru intervenții nutriționale personalizate, oferind posibilitatea unor corecții țintite și specifice, care țin cont de compoziția bacteriană intestinală. În cadrul acestora, efectul fiziologic dorit poate fi obținut prin introducerea, eliminarea sau modificarea conștientă a proporțiilor anumitor componente ale dietei – de exemplu macronutrienți, anumite tipuri de fibre sau substanțe active de origine vegetală.

Limitele sale:

• Mai costisitoare decât metodele mai simple
• Necesită o prelucrare și o interpretare complexă a datelor

Compararea secvențierii shotgun cu cea bazată pe 16S rRNA

Secvențierea bazată pe 16S rRNA vizează o singură genă conservată a bacteriilor, fiind astfel potrivită în principal pentru identificarea la nivelul genului, cu o precizie limitată la nivel de specie. În schimb, metagenomica shotgun secvențiază întregul ADN microbian dintr-o probă, permițând identificarea la nivel de specie, precum și cartografierea genelor funcționale și a proceselor metabolice. Datorită sensibilității sale ridicate, metoda este capabilă să detecteze orice microorganism a cărui proporție depășește 0,01% din probă și poate identifica chiar și specii necunoscute anterior. În plus, detectează nu doar bacterii, ci și virusuri, fungi și arhee, oferind astfel o imagine mai complexă asupra comunității microbiene.

În timp ce 16S oferă o abordare mai rapidă, mai ieftină și mai simplă, metagenomica shotgun asigură o analiză mai detaliată și mai cuprinzătoare, este adevărat, cu costuri mai mari și cu o cerință mai ridicată de resurse informatice în fundal.

Prezentare comparativă

De ce am ales noi metagenomica shotgun?

Analiza de metagenomică shotgun cu care lucrăm detectează fiecare specie bacteriană identificată de știință, în cazul în care aceasta atinge pragul de măsurare de 0,01%, și fiecare specie de fungi care atinge pragul de 0,001%. Oferă informații și despre toxine și produși metabolici, produși de bacteriile prezente în intestin, precum și despre ce proporție a speciei respective produce toxine, și detectează totodată gene de rezistență, de care se poate ține cont în cazul unui tratament antibiotic planificat, la alegerea antibioticului. Conține, în plus, un marker denumit „fundal uman”, care arată în ce proporție se găsește ADN uman în raport cu ADN-ul bacterian identificat în probă. ADN-ul uman găsit în probă poate proveni din celule epiteliale intestinale moarte, din celule imunitare (puroi) sau din sânge, iar o valoare crescută a acestuia este un semnal de atenție că poate exista o leziune a epiteliului intestinal, o inflamație sau, în cazuri mai grave, eventual o tumoră.

Cunoașterea caracteristicilor funcționale ale bacteriilor este esențială și din punct de vedere clinic, deoarece, de exemplu, o Escherichia coli producătoare de toxine necesită un tratament complet diferit față de o Escherichia fergusonii din tractul urinar. Totodată, nu doar agenții patogeni bine cunoscuți pot cauza probleme: anumite bacterii considerate în principiu benefice pot deveni și ele dăunătoare dacă se înmulțesc excesiv, deoarece astfel perturbă echilibrul microbian al intestinului, răpesc spațiul vital altor bacterii benefice, iar produșii lor metabolici, altminteri utili, în cantități excesive pot avea un efect puternic coroziv (de ex. acidul butiric, succinatul) sau dăunător în alt mod, putând cauza și probleme metabolice (de ex. acidul lactic). Un aspect important este, de asemenea, dacă o anumită specie bacteriană este benefică sau dacă este prezentă o variantă a sa producătoare de toxine grave (de ex. Bacteroides fragilis). Multe specii bacteriene sunt capabile de o producere ușoară sau mai serioasă de toxine, iar cunoașterea acestui lucru poate ajuta la alegerea corectă a strategiei terapeutice adecvate, precum și a substanțelor active necesare. Pe baza datelor obținute în cursul analizei, elaborăm o recomandare personalizată, construită pas cu pas, adaptată profilului individual al microbiomului, stilului de viață și obiectivelor de sănătate, care, în funcție de problemă, se întinde pe 1–3 luni.

Alte analize conexe

Pe lângă analiza microbiomului, scalele de simptome, alte analize de laborator, rezultatele recoltării de sânge, markerii inflamatori, testele de alergie și de intoleranță alimentară, profilurile hormonale oferă împreună o imagine cuprinzătoare asupra stării actuale a organismului.

Informațiile prezentate aici nu înlocuiesc diagnosticul medical și nu reprezintă un ghid pentru tratamentul vreunei boli.